Huntington’s disease (HD) is a fatal neurodegenerative disorder caused by a toxic gain- of-function CAG expansion in the first exon of the huntingtin (HTT) gene. Striatal neurodegeneration is the main hallmark in HD, but cortical neurons are also affected at early stages of the disease. Currently, there are no treatments stopping or slowing disease progression. The monogenic nature of HD makes CRISPR/Cas9-mediated HTT inactivation a promising therapeutic strategy. To facilitate the development of CNS gene therapies and maximize therapeutic efficacy for HD, we first developed 2D and 3D imaging workflows to evaluate the therapeutic potential of a novel strategy for HD by assessing transduction efficiency in multiple brain regions. We combine the retrograde transport properties of the AAV2.retro with the broad striatal diffusion of the AAV2/rh.10 to simultaneously inactivate the HTT gene in both striatal (SPNs) and cortical projection neurons (CPNs). Because constitutive SpCas9 expression increases the likelihood for the occurrence of off-target events and immunogenic responses, we used a transient AAV-based KamiCas9 system. Our analysis predicted that 54% of striatal cells and 7% of cortical cells had been transduced in highly targeted brain regions. Remarkably, in those regions, HTT gene inactivation reached 54.5% and 9.6%, respectively. These results validate the maximized therapeutic strategy and demonstrate the power of these quantitative workflows to predict the potential of gene therapy strategies for neurological disorders. Nevertheless, it is still unclear to which extent the loss of the wild-type HTT (wtHTT) normal functions may impact on disease progression. One of the current allele-specific therapeutic strategies for HD consists of the excision of the first exon of mutant HTT allele (mHTT) by inducing simultaneous double-strand breaks at upstream and downstream positions of the mHTT exon 1. However, its efficiency has never been assessed. Given the ultimate goal for clinical application, it is critical to accurately determine its efficiency to anticipate therapeutic potential. Therefore, here we developed digital PCR-based assays to accurately quantify the frequency of HTT exon 1 deletion events. Consistently with previous studies, we observed that deletion events are frequent in vitro, but extremely rare in vivo. Our results do not support the application of dual sgRNA-based deletion strategies for the in vivo treatment of HD or other CNS disorders. In addition, we highlight that the current methodologies to evaluate deletion events greatly overestimate their frequency. Overall, we encourage the scientific community to adopt more quantitative methods when analyzing complex gene editing events to avoid misleading conclusions concerning the applicability of such therapeutic strategies in vivo.
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La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodĂ©gĂ©nĂ©rative mortelle causĂ©e par une expansion CAG toxique Ă  gain de fonction dans le premier exon du gène de la huntingtine (HTT). Cette maladie se caractĂ©rise principalement par la dĂ©gĂ©nĂ©rescence des neurones striataux, mais les neurones corticaux sont Ă©galement touchĂ©s dans les premiers stades de la maladie. Actuellement, il n’existe aucun traitement capable d’arrĂŞter ou de ralentir la progression de la maladie. La nature monogĂ©nique de la MH fait de l’inactivation HTT mĂ©diĂ©e par CRISPR/Cas9 une stratĂ©gie thĂ©rapeutique prometteuse. Pour faciliter le dĂ©veloppement de thĂ©rapies gĂ©niques pour des maladies qui affectent le SNC et maximiser son efficacitĂ© thĂ©rapeutique pour la MH, nous avons dĂ©veloppĂ© des flux de travails basĂ©s sur de l’imagerie 2D et 3D. Cette mĂ©thodologie permet d’Ă©valuer le potentiel thĂ©rapeutique d’une nouvelle stratĂ©gie pour la MH en Ă©valuant l’efficacitĂ© de la transduction dans plusieurs rĂ©gions du cerveau. Nous avons combinĂ© les propriĂ©tĂ©s de transport rĂ©trograde de l’AAV2.retro avec la large diffusion striatale de l’AAV2/rh.10 pour inactiver simultanĂ©ment le gène HTT dans les neurones de projection striataux (NPSs) et corticaux (NPCs). Nous avons utilisĂ© un système AAV-KamiCas9 transitoire car l’expression constitutive de SpCas9 augmente la possibilitĂ© d’Ă©vĂ©nements hors cible et de rĂ©actions immunogènes. Les prĂ©dictions, selon notre analyse, sont que 54% des cellules striatales et 7% des cellules corticales ont Ă©tĂ© transduites dans des rĂ©gions cĂ©rĂ©brales hautement ciblĂ©es. De façon remarquable, dans ces rĂ©gions, l’inactivation du gène HTT a atteint 54,5% et 9,6%, respectivement. Ces rĂ©sultats valident la stratĂ©gie thĂ©rapeutique maximisĂ©e et dĂ©montrent la puissance de ces flux de travail pour prĂ©dire quantitativement le potentiel des stratĂ©gies de thĂ©rapie gĂ©nique pour les maladies neurologiques. NĂ©anmoins, on ne sait toujours pas dans quelle mesure la perte des fonctions normales de la HTT de type sauvage (wtHTT) peut avoir un impact sur la progression de la maladie. L’une des stratĂ©gies thĂ©rapeutiques actuelles, spĂ©cifique Ă  l’allèle, pour la MH consiste Ă  exciser le premier exon de l’allèle HTT mutant (mHTT) en induisant des cassures double brin simultanĂ©es en amont et en aval de l’exon 1 de la mHTT. Cependant, son efficacitĂ© n’a jamais Ă©tĂ© Ă©valuĂ©e. Compte tenu de l’objectif ultime d’une application clinique, une dĂ©termination prĂ©cise de l’efficacitĂ© est essentielle pour anticiper le potentiel thĂ©rapeutique. Par consĂ©quent, nous avons dĂ©veloppĂ© ici des tests basĂ©s sur la PCR digitale pour quantifier avec prĂ©cision la frĂ©quence des Ă©vĂ©nements de dĂ©lĂ©tion de l’exon 1 du HTT. ConformĂ©ment aux Ă©tudes prĂ©cĂ©dentes, nous avons observĂ© que les Ă©vĂ©nements de dĂ©lĂ©tion sont frĂ©quents in vitro, mais extrĂŞmement rares in vivo. Nos rĂ©sultats ne soutiennent pas l’application de stratĂ©gies de dĂ©lĂ©tion Ă  base de double sgRNA pour le traitement in vivo de la MH ou d’autres maladies affectantle SNC. Par ailleurs, les mĂ©thodologies d’Ă©valuation actuelles surestiment largement la frĂ©quence d’évĂ©nements de dĂ©lĂ©tion. Dans l’ensemble, la communautĂ© scientifique devrait adopter des mĂ©thodes plus quantitatives lors de l’analyse des Ă©vĂ©nements complexes d’Ă©dition de gènes afin d’Ă©viter des conclusions trompeuses concernant l’applicabilitĂ© de telles stratĂ©gies thĂ©rapeutiques in vivo.